Ekstraksi & Isolasi Protein

1. 1 Teori Dasar
Pemurnian protein merupakan tahap yang harus dilakukan untuk mempelajari sifat dan fungsi protein. Isolat protein merupakan bentuk sediaan protein dari bahan pangan yang paling murni karena kadar proteinnya minimum 95% dalam berat kering. Isolat protein hampir bebas dari karbohidrat, serat, dan lemak.
Untuk mengisolasi dan mengekstrak protein, perlu diketahui faktor-faktor yang mempengaruhi kelarutan protein diantaranya: pH, keberadaan garam, dan polaritas pelarut.

1.2 Pengaruh Garam terhadap Kelarutan Protein

Adanya garam dapat meningkatkan atau menurunkan kelarutan protein. Hal ini karena penambahan garam akan mempengaruhi kekuatan ion dalam larutan, yang berpengaruh pula terhadap kelarutan protein. Pada umumnya, jika kelarutan ion meningkat maka kelarutan protein akan semakin besar pula. Pengaruh garam dalam meningkatkan kelarutan protein disebut efek salting-in. Pada konsentrasi yang lebih tinggi lagi atau pada konsentrasi garam yang lebih tinggi, kelarutan protein akan menurun. Efek garam dalam menurunkan kelarutan protein disebut efek salting-out.

Peristiwa salting-in dan salting-out dapat dijelaskan sebagai berikut: "Pada kekuatan ion rendah, gugus protein yang terionisasi dikelilingi oleh ion lawan, sehingga interaksi antar protein akan menurun dan kelarutannya meningkat. Sebaliknya, apabila kekuatan ion meningkat akan lebih banyak molekul air yang diikat oleh ion, sehingga tidak cukup untuk menghidrasi molekul-molekul protein yang mengakibatkan interaksi antar molekul protein lebih kuat dan kelarutannya menurun (mengendap)".

Kelarutan merupakan fungsi dari kekuatan ion yang dapat diukur dari konsentrasi, molar dari ion, dan muatannya.

Protein dapat diendapkan dari larutan aqueous dengan penambahan garam-garam netral dalam konsentrasi tinggi (salting-out). Garam yang sering digunakan adalah amonium sulfat, natrium sulfat, garam-garam magnesium, dan garam fosfat.

1.3 Pengaruh Polaritas pada Kelarutan Protein

Penambahan pelarut non-polar yang miscible (dapat bercampur dengan air dalam berbagai perbandingan) ke dalam larutan protein dapat menurunkan kelarutan protein. Pelarut tersebut adalah etanol, metanol, dan aseton. Pelarut-pelarut tersebut menurunkan konstanta dielektrik larutan atau medium yang menyebabkan peningkatan gaya tarik menarik antar jenis muatan pada protein. Akibatnya interaksi antar protein meningkat, sehingga kelarutan protein menurun (mengendap).

1.4 Ekstraksi dan Isolasi Protein
Dalam mengisolasi protein dalam bahan pangan, mula-mula protein diekstraksi dengan pengaturan pH yang memungkinkan protein terekstrak paling banyak. Kemudian protein terlarut dipisahkan dari bagian non-protein dengan cara pengendapan menggunakan sentrifus. Protein yang ada dalam larutan selanjutnya diendapkan dengan pengaturan pH sampai titik isoelektrik atau penambahan garam pada konsentrasi yang memungkinkan pengendapan protein. Hasil yang diperoleh disebut Isolat Protein. Biasanya nama isolat protein dihubungkan dengan sumber bahannya, misalnya isolat protein kedelai, isolat protein kacang hijau, dan sebagainya. Jika setelah pencucian dilakukan netralisasi dengen penambahan NaOH 2N sampai pH 6-8, lalu dikeringkan maka produk tersebut disebut isolat proteinat.

2.1 Perubahan Kelarutan Protein dalam Larutan Garam
Alat:
<#> Spektrofotometer (panjang gelombang: 595 nm)
<#> Timbangan
<#> Sentrifuse
<#> Magnetik Stirrer
<#> Tabung reaksi
<#> Pipet Volumetrik 10 ml
<#> Vortex
<#> Labu Ukur 100 ml

Pereaksi: 
<#> Larutan Garam NH₄SO₄
<#> Pereaksi Bradford. Pembuatan : Larutkan 100 mg Coomassie briliant blue G-250 dalam 50 ml etanol 90%. Tambahkan 100 ml larutan asam fosfat 85% dan encerkan dengan akuades sampai 1 L. Saring larutan dengan kertas saring. Larutan ini dapat disimpan beberapa bulan pada suhu dingin (0^oC-5^oC)

Bahan:
<#> Susu bubuk skim
<#> Tepung kedelai
<#> Tepung kacang hijau
<#> Makanan bayi
<#> Susu kedelai bubuk
<#> Tepung terigu

Prosedur Kerja:

1. Siapkan masing-masing 10 ml suspensi atau 4 tabung/10 ml (0.5-1.0 gram sampel dicampur 10 ml air) sampel di dalam 4 buah tabung reaksi;
2. Tambahkan garam amonium sulfat dengan konsentrasi yang berbeda (0%, 5%, 10%, 20%, dan 25%);
3.  Vortex semua tabung, lalu diamkan 5-10 menit. Sentrifusi 2500 rpm selama 10 menit dan ukur konsentrasi protein pada supernatan menggunakan pereaksi Bradford
4. Buat kurva hubungan antara kelarutan protein dengan konsentrasi garam. Sumbu Y adalah konsentrasi protein dan sumbu X adalah variasi konsentrasi garam.
5. Tentukan pada konsentrasi berapa masing-masing sampel paling banyak mengendap dan pada konsentrasi berapa garam paling banyak larut.

2.2 Pengaruh Polaritas Pelarut terhadap Kelarutan Protein

Alat :

<#> Spektrofotometer

<#> Timbangan

<#> Sentrifuse

<#> Magnetik Stirer

<#> Alat gelas : tabung reaksi, pipet, labu takar 100 ml

<#> Vortex

Pereaksi:

<#> Pelarut Aseton

Bahan:

<#> Susu bubuk skim

<#> Tepung kedelai

<#> Tepung kacang hijau

<#> Makanan Bayi

<#> Susu Kedelai Bubuk

<#> Tepung Terigu

Prosedur Kerja:

1. Siapkan 10 ml suspensi (0.5-1 gram sampel dicampur dengan 10 ml air) masing-masing sampel dan campurkan dengan aseton dingin dengan perbandingan 1:1, 1:2, 2:1, dan 3:1;
2. Vortex semua tabung, lalu diamkan selama 5-10 menit. Ambil 2 ml untuk dilakukan sentrifuse 2500 rpm selama 10 menit dan ukur konsentrasi protein pada supernatan menggunakan pereaksi Bradford;
3. Buat kurva kelarutan dengan sumbu Y adalah konsentrasi protein pada filtrat, sedangkan sumbu X adalah perbandingan suspensi sampel dan aseton;
4. Tentukan pada perbandingan berapa masing-masing protein paling banyak mengendap.

2.3 Ekstraksi dan Isolasi Protein (Pembuatan Isolat Protein)

Alat :

<#> Sentrifuse

<#> Penangas Air

<#> Magnetik Stirer

<#> pH-meter

<#> Oven vakum

Pereaksi:

<#> larutan NaOH 1N

<#> Larutan HCl 2N

Bahan:

<#> Susu bubuk skim

<#> Tepung kedelai

<#> Tepung kacang hijau

<#> Tepung Terigu

<#> Susu Bubuk Kedelai

Prosedur Kerja:

1. Suspensikan masing-masing tepung dalam air dengan perbandingan tepung : air = 1 (gr) :8 (ml). Atur pH pada 8.5-8.7 dengan penambahan NaOH 2N, lalu aduk selama 30 menit pada suhu 50-55^oC sehingga protein terekstrak;
2. Setelah protein terekstrak, pisahkan residu non-protein dengan sentrifusi pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Tahap ini akan menentukan kemurnian isolat protein yang dihasilkan;
3. Turunkan pH dari supernatan yang mengandung protein terlarut dari hasil tahapan pemisahan sampai pH 4.5 dengan HCl 2N. Penurunan pH ini akan menyebabkan protein mengendap;
4. Pisahkan endapan protein yang diperoleh dengan cara sentrifusi (3000 rpm, 10 menit). Kemudian, cuci endapan tersebut dengan cara penambahan air dan disentrifusi lagi (2500 rpm, 10 menit). Keringkan dengan pengering beku dan oven vakum;
5. Timbang isolat protein yang diperoleh dan hitung rendemennya.