Pengukuran Aktivitas Enzim

1.1 Teori Dasar
Enzim merupakan biokatalisator yang sangat efektif dalam meningkatkan kecepatan reaksi kimia secara spesifik yang mana ketika kondisi tanpa enzim reaksi biokimia berlangsung secara lambat. Pengukuran aktivitas enzim dapat dilakukan dengan mengukur substrat yang terurai atau produk yang terbentuk. Terdapat berbagai jenis enzim yang sering digunakan dalam proses pangan, misalnya protease, amilase, dan lipase.

1.2 Protease

Protease merupakan enzim yang berperan dalam reaksi yang melibatkan pemecahan protein. Enzim ini memecah protein dengan bantuan air sehingga dikelompokkan dalam golongan enzim hidrolase. Protease dapat dihasilkan dari hewan, tanaman, dan mikroba secara ekstraseluler ataupun intraseluler. Dalam sistem EC (Enzyme Nomenclature), protease dibagi menjadi eksopeptidase (EC 3.4.11-19) dan endopeptidase (EC 3.4.21-24). Eksopeptidase menghidrolisis protein dari ujung N terminal (aminopeptidase), C terminal (karboksipeptidase), ataupun spesifik pada dipeptida (hidrolase dipeptidase). Endopeptidase dibagi berdasarkan mekanisme katalitiknya, yaitu proteinase serin, proteinase thiol, proteinase asam dan proteinase logam.

Pengukuran aktivitas protease dapat dilakukan dengan mengukur asam amino yang terbentuk. Salah satu metode pengukuran aktivitas protease adalah Metode Bergmeyer dan Grassl (1983). Prinsip pengukuran berdasarkan pada hidrolisis kasein oleh protease menghasilkan asam amino. Aktivitas enzim diukur berdasarkan laju pembentukan asam amino. Pengukuran ini dilakukan dalam beberapa langkah, yaitu

(1) reaksi pemecahan kasein menjadi asam amino;
(2) penghentian reaksi dengan penambahan TCA untuk inaktivasi enzim;
(3) pemisahan asam amino dari enzim protease dan kasein yang tidak terurai;
(4) pewarnaan asam amino dan pengukuran absorbansi.

1.3 Amilase

Enzim amilase merupakan enzim yang dapat memecah pati atau menghidrolisa pati, glikogen, dan turunan polisakarida dengan memecah ikatan glikosidik pati. Berdasarkan jenis ikatan yang dipecahnya, amilase dibedakan menjadi α-amilase (EC-3.2..1.1), ß-amilase (EC-3.2.1.2), γ-amilase (EC-3.2.1.3). Hidrolisis enzim α-amilase terhadap pati menghasilkan produk utama yaitu maltosa dan maltooligosakarida.

Pengukuran aktivitas amilase dapat dilakukan dengan mengukur produk sakarida sederhana yang terbentuk. Salah satu metode pengukuran aktivitas amilase adalah Metode Bernfeld (1955). Prinsip pengukuran berdasarkan pada hidrolisis amilosa oleh amilase yang menghasilkan maltosa pada suhu 37^oC inkubasi selama waktu tertentu. Maltosa yang terbentuk diukur dengan menggunakan metode spektrofotometri menggunakan pereaksi DNS. Pereaksi DNS dengan maltosa akan membentuk kompleks warna merah bata yang diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm. Rekasi tersebut berlangsung pada kondisi suhu tinggi. Panas yang digunakan juga untuk menginaktivasi enzim.

1.4 Lipase

Lipase dikelompokkan sebagai enzim hidrolase dengan nama sistematik gliserol ester hidrolase (EC 3.1.1.3) yang mengkatalisis reaksi hidrolisis trigliserida menjadi asam lemak bebas, gliserida parsial, dan gliserol. Reaksi hidrolisis enzim lipase merupakan reaksi yang terjadi secara bertahap menghasilkan diasilgliserol dan monoasilgliserol sebagai senyawa antara.

Pengukuran aktivitas lipase dapat dilakukan dengan mengukur produk asam lemak bebas yang terbentuk. Salah satu metode pengukuran aktivitas lipase adalah Metode Lienfield (1984). Prinsip pengukuran berdasarkan pada hidrolisis lemak oleh lipase menghasilkan asam lemak bebas. Asam lemak bebas yang terbentuk diukur dengan menggunakan metode titrimetri dengan menggunakan larutan NaOH.

2.1 Pengukuran Aktivitas Enzim Protease

Alat :

<-> Spektrofotometer UV-Vis

<-> Penangas Air

<-> Stopwatch

<-> Tabung sentrifusi 15 ml

<-> Gelas Piala (200,500, dan 1000 ml)

<-> Labu takar

<-> Sentrifuse

<-> Alat Gelas

Pereaksi :

<-> Larutan buffer borat ph 8.0. Disimpan pada suhu 4^oC dan stabil selama 2 minggu. Pembuatan: Buffer borat pH 8.0 dibuat dengan mencampurkan 50 ml larutan A dengan 4.9 ml larutan B kemudian diencerkan dengan akuades sampai volume 200 ml.

<-> Larutan buffer kasein 2% (b/v). Pembuatan: Larutkan 1 g kasein dalam 5 ml akuades, tambahkan 1,3 ml NaOH 1M dan 30 ml akuades lalu distirer hingga semua kasein larut. Tambahkan 5 ml buffer borat. Atur hingga larutan mencapai pH 8.0 dengan menambahkan HCl 1M sambil terus diaduk agar tidak terjadi pengendapan kasein. Tepatkan volumenya menjadi 50 ml dengan penambahan akuades. Harus disiapkan setiap hari. Disimpan pada suhu 4^oC dan stabil selama 2 minggu.

<-> Larutan tirosin standar 5 mmol/L. Pembuatan: larutkan 45,3 mg tirosin dalam 50 ml akuades. Disimpan pada suhu 4^oC dan stabil selama 2 minggu.

<-> Larutan CaCl₂ 12 mmol/L. Pembuatan: larutkan 66,5964 mg CaCl₂ dalam 50 ml akuades.

<-> Asam trikloroasetat 0.1 mol/L. Pembuatan: larutkan 16,3 g TCA dalam 1 L akuades.

<-> Larutan CaCl₂ 2 mmol/L

<-> Larutan Na₂CO₃ 0.4 mol/L. Pembuatan: larutkan 42,397 g Na₂CO₃ dalam 1 L akuades.

<-> Pereaksi folin.

Prosedur Kerja :

Siapkan 3 buah tabung reaksi. Ke dalam masing-masing tabung reaksi, tambahkan pelarut seperti tercantum dalam tabel dibawah ini secara berurutan;

Pereaksi	Tabung I: Sampel	Tabung II: Blanko	Tabung III: Standar
Buffer borat pH 8	1.0	1.0	1.0
Buffer kasein	1.0	1.0/4%	1.0/4%
Tirosin Standar (Substrat)	-	-	0.2
Akuades	-	0.2	-
Larutan Enzim	0.2	-	-

Inkubasikan semua tabung tersebut dengan penangas air 37^oC selama 10 menit;
Lalu tambahkan TCA (inaktivasi), akuades, dan larutan enzim seperti tercantum pada tabel berikut:

Pereaksi

Tabung I: Sampel

Tabung II: Blanko

Tabung III: Standar

TCA

2.0

2.0

2.0

Akuades

0.2

-

-

Larutan Enzim

-

0.2

0.2
Inkubasi lagi semua tabung tersebut dalam penangas air 37^oC selama 10 menit, kemudian sentrifusi pada 3000 rpm selama 15 menit;
Ambil 1.5 ml dari supernatan masing-masing tabung dan pindahkan pada tabung reaksi lain. Tambahkan 5 ml larutan Na₂CO₃ dan 1.0 ml pereaksi folin;
Inkubasi dalam penangas air 37^oC selama 10 menit. Ukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 578 nm.

Perhitungan :

2.2 Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase

Alat :

<-> Penangas Air

<-> Spektrofotometer UV-Vis

Bahan:

<-> Pereaksi DNS. Pembuatan: Larutkan 5 g asam 3.5-dinitrosalisilat dalam 100 ml larutan NaOH 2N lalu ditambahkan 250 ml akuades, diaduk hingga DNS larut. Kemudian tambahkan 150 g Na-K Tartarat, aduk, lalu encerkan dengan 250 ml akuades. Titrasi 3 ml pereaksi DNS dengan HCl 0.1 N dan indikator fenolftalein. Seharusnya membutuhkan 5-6 ml HCl 0.1N, jika kurang dari itu tambahkan 2 g NaOH untuk setiap kekurangan 0.1 ml HCl 0.1N;

<-> Buffer fosfat sitrat pH 7.0. Pembuatan: Buffer fosfat sitrat pH 7.0 dibuat dengan mencampurkan 8.82 ml larutan asam sitrat 0.1M (21.014 g asam sitrat/1 L akuades) dengan 41.18 ml larutan Na₂HPO₄ /1L akuades. Setelah dilakukan pengaturan pH 7, lakukan pengenceran hingga volume 100 ml dengan akuades.

<-> Larutan maltosa konsentrasi 100, 200, 300, 400, dan 500 ppm;

<-> Soluble starch 2%

Prosedur Kerja :

Ambil 0.1 ml supernatan ke dalam tabung reaksi;
Tambahkan 0.9 ml buffer fosfat sitrat pH 7 (mengoptimalkan kondisi);
Inkubasi pada penangas air 37^oC selama 5 menit;
Tambahkan 2 ml substrat soluble starch 2% dalam buffer fosfat sitrat pH 7 yang telah digelatinisasi;
Inkubasi pada penangas air 37^oC selama 30 menit;
Tambahkan 3 ml pereaksi DNS;
Inaktivasi enzim dengan pencelupan dalam air mendidih selama 5 menit;
Dinginkan selama 15 menit;
Ukur absorbansi pada panjang gelombang 550 nm;
Lakukan hal yang sama pada larutan standar dan blanko. Sebagai larutan standar gunakan larutan maltosa standar (100, 200, 300, 400, dan 500 ppm). Blanko yang digunakan adalah akuades.