Pengukuran Kinetika Enzim

Teori Dasar

Kinetika Enzim --> Enzim adalah katalis yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi dengan cara menurunkan energi aktivasi. Energi aktivasi merupakan pembatas untuk terjadinya pembentukan fase transisi sebelum menghasilkan produk dan substrat. Fase transisi tersebut merupakan fase terbentuknya kompleks Enzim-Substrat (E-S). 

Mekanisme enzim merupakan urutan langkah untuk mengkonversi substrat menjadi produk melalui reaksi enzimatis. Setelah substrat terikat dengan enzim, ikatan akan terputus kembali yang diikuti dengan pelepasan produk oleh enzim.

Dalam reaksi enzimatis, peningkatan konsentrasi substrat akan mencapai suatu kecepatan maksimum, dimana penambahan substrat selanjutnya tidak akan menambah kecepatan reaksi.

Persamaan Michaelis-Menten

Persamaan Michaelis-Menten menunjukkan hubungan kuantitatif antara kecepatan awal, kecepatan maksimum, konsentrasi awal substrat dan Km. Kecepatan reaksi pada awal reaksi tergantung pada konsentrasi substrat. Semakin tinggi konsentrasi, kecepatan reaksi semakin lambat dan akhirnya tidak dipengaruhi lagi oleh konsentrasi. Dengan pola tersebut, maka kurva kecepatan reaksi vs konsentrasi substrat akan berbentuk hiperbolik. Hal ini merupakan karakteristik reaksi enzim dalam model Michaelis-Menten. Grafik ini khas untuk setiap proses yang mencapai kejenuhan. Persamaan Michaelis-Menten dapat dinyatakan sebagai berikut :

Persamaan Lineweaver-Burk

Persamaan Michaelis-Menten sulit untuk digunakan menentukan nilai konstanta Michaelis-Menten (Km) dan kecepatan maksimum (Vmax). Hans Lineweaveer dan Dean Burk membuat transformasi persamaan tersebut ke dalam bentuk persamaan linier. Pada persamaan Lineweaver-Burk, persamaan Michaelis-Menten ditransformasi menjadi garis lurus dengan cara mengatur kembali kedua sisi persamaan pada Michaelis-Menten. Plot Lineweaver-Burk merupakan hubungan garis lurus antara 1/V sumbu y dengan 1/[S] pada sumbu x. Dengan persamaan garis lurus akan lebih mudah diperoleh informasi untuk mendapatkan Vmax atau Km. Nilai Vmax dapat diperoleh dari kebalikan nilai intersept (1/Vmax), sedangkan nilai Km dapat diperoleh dari nilai slope (Km/Vmax)

Percobaan & Perhitungan Kinetikan Enzim
Perhitungan kinetika enzim dilakukan dengan melakukan serangkaian percobaan pengukuran kecepatan reaksi enzim pada berbagai konsentrasi substrat. Nilai kecepatan enzim yang diperoleh ditransformasikan ke dalam persamaan Lineweaver-Burk dengan merubah menjadi 1/V dan konsentrasi substrat menjadi 1/[S].

1.1 : Penentuan Nilai Km dan Vmax
Alat :
<-> Spektrofotometer dan kuvet;
<-> Tabung reaksi bertutup;
<-> Penangas air;
<-> Stopwatch;
<-> Sentrifuse.

Pereaksi :
<-> Enzim papain 1%. Pembuatan: larutan enzim 1 ml ditambah dengan 0.2 ml larutan CaCl₂ 12 mmol/L. Disimpan pada suhu beku dalam freezer;
<-> Larutan NaOH 1 M;
<-> Larutan buffer borat pH 8,0. Penyimpanan: pada suhu 4^oC dan stabil selama 2 minggu;
<-> HCl 1M;
<-> HCl 0.05 M;
<-> Larutan buffer kasein 2% (b/v). Harus disiapkan tiap hari. Disimpan pada suhu 4^oC dan stabil selama 2 minggu;
<-> Larutan tirosin standar 5 mmol/L. Penyimpanan: pada suhu 4^oC dan stabil selama 2 minggu;
<-> Larutan CaCl₂ 12 mmol/L;
<-> Asam trikloroasetat 0.1 mol/L
<-> Larutan CaCl₂ 2 mmol/L;
<-> Larutan Na₂CO₃ 0.4 mol/L;
<-> Pereaksi Folin.

Prosedur Kerja :

• Siapkan larutan enzim, larutan kasein stok 4% diencerkan menjadi 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.75%, 0.5%, dan 0.25%;
• Lakukan pengukuran produk yang terbentuk per satuan waktu seperti pada pengukuran aktivitas enzim protease pada masing-masing konsentrasi substrat kasein di atas pada suhu 37^oC dan buffer universal pH 6.0. Konsentrasi masing-masing pereaksi untuk sampel, blanko dan standar dapat dilihat pada tabel berikut:

  Pereaksi	Tabung I: Sampel	Tabung II: Blanko	Tabung III: Standar
  Buffer borat pH 8	1.0	1.0	1.0
  Buffer kasein	1.0	1.0/4%	1.0/4%
  Tirosin Standar	-	-	0.2
  Akuades	-	0.2	-
  Larutan Enzim	0.2	-	-

• Inkubasikan semua tabung tersebut dalam penangas air 37^oC selama 10 menit; 
• Lalu tambahkan TCA, akuades, dan larutan enzim seperti tercantum pada tabel berikut:

  Pereaksi	Tabung I: Sampel	Tabung II: Blanko	Tabung III: Standar
  TCA	2.0	2.0	2.0
  Akuades	0.2	-	-
  Larutan Enzim	-	0.2	0.2

• Inkubasi dalam penangas air 37^oC selama 10 menit, kemudian sentrifusi pada 4000 rpm selama 10 menit;
• Ambil 1.5 ml dari supernatan dari masing-masing tabung dan pindahkan pada tabung reaksi lain. Tambahkan 5 ml larutan Na₂CO₃ dan 1.0 ml pereaksi folin;
• Inkubasi dalam penangas air 37^oC selama 10 menit. Kemudian ukur absorbansinya dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 578 nm.

Perhitungan :

1. Hitung aktivitas enzim pada masing-masing konsentrasi substrat kasein dengan rumus berikut:
   
2. Buat hubungan antara aktivitas enzim pada sumbu Y dan Konsentrasi Substrat pada sumbu X (persamaan Michaelis-Menten);
3. Buat transformasi Lineweaver-Burk dan hitung nilai Km dan Vmax bagi enzim protease tersebut.