Spektrofotometri: Pembuatan Larutan Standar dan Uji Stabilitas Vitamin C

Teori Dasar

Spektrofotometri merupakan metode analisis instrumental menggunakan dasar interaksi energi dan materi. Energi berupa radiasi elektromagnetik, sedangkan materi berupa atom/molekul dalam suatu senyawa kimia. Hasil interaksi antara energi dan materi tersebut menimbulkan beberapa peristiwa antara lain absorpsi, transmisi, difraksi, dan emisi. Absorpsi melahirkan spektrofotometri sinar tampak/visible, ultra violet, infra merah dan serapan atom. Difraksi melahirkan spektrometri difraksi sinar X (X-ray diffraction), sedangkan absorpsi dan emisi melahirkan spektrofluorosensi dan fosforesensi.

Hubungan warna dan panjang gelombang

Radiasi elektromagnetik yang dapat dilihat oleh mata disebut sinar tampak yang meliputi daerah panjang gelombang antara 400-700 nm yang merupakan campuran dari warna-warna yang terlihat di pelangi.

Apabila suatu larutan dikenai sinar polikromatik, maka suatu berkas sinar dengan panjang gelombang tertentu yang diserap, sedangkan berkas sinar yang lainnya diteruskan melalui larutan tersebut. Warna dari sinar yang diteruskan merupakan warna dari larutan yang disebut warna komplementer dari warna sinar yang diserap. Sebagai contoh apabila suatu larutan menyerap bagian sinar biru dari spektrum warna, maka larutan terlihat berwarna kuning, yaitu komplementer warna biru.

Tabel. Warna dan warna komplementer spektrum sinar tampak

Panjang Gelombang (nm)	Warna	Warna Komplementer
400-435 435-480 480-490 490-500 500-560 560-595 595-610 610-680 680-700	Violet/Ungu Biru Biru-Kehijauan Hijau-Kebiruan Hijau Hijau-Kekuningan Jingga Merah Ungu-Kemerahan	Hijau-Kekuningan Kuning Jingga Merah Ungu-Kemerahan Ungu Biru-Kehijauan Hijau-Kebiruan Hijau

Interaksi radiasi elektromagnetik dengan materi

Setiap atom/senyawa mempunyai tingkatan energi tertentu yang spesifik. Pada suhu kamar umumnya setiap materi akan berada pada suatu keadaan yang paling stabil disebut keadaan tingkat ground state dengan energi sebesar E_o .

Apabila seberkas sinar/radiasi elektromagnetik dikenakan dengan sebuah materi akan menyebabkan elektron-elektron senyawa pada ground state (E_o) akan dieksitasikan ke tingkat eksitasi tertentu sesuai dengan perbedaan besarnya energi yang diterima. Bila E = E₂ - E_o maka atom/senyawa tersebut akan tereksitasi ke tingkat eksitasi kedua (E₂). Proses perpindahan tingkat energi tersebut terjadi karena diserapnya energi dari sinar oleh materi. Besarnya perbedaan energi dari E_o ke tingkat tereksitasi tertentu bersifat spesifik untuk setiap atom/molekul. Proses penyerapan terjadi bila besarnya energi radiasi yang diberikan pada zat kimia tersebut sama besarnya dengan energi yang dibutuhkan zat kimia tersebut untuk beralih ke tingkat tereksitasi tertentu. 

Absorbansi, transmitan, dan hukum Beer

Ketika suatu cahaya/energi mengenai suatu materi/sampel maka sebagian akan diserap dan sebagian akan diteruskan. Jumlah cahaya yang diserap oleh materi disebut Absorbansi (A), sedangkan Transmitan (T) merupakan proporsi cahaya yang diteruskan dan didefinisikan sebagai perbandingan intensitas cahaya yang melewati larutan blanko (I_o) dengan intensitas cahaya yang melewati larutan sampel (I). Rumus :

Hubungan antara Absorbansi dengan Transmitan digambarkan dalam sebuah persamaan berikut :

A=-log T

Persamaan garis lurus A (absorbansi) vs C (konsentrasi) pada kurva standar dikenal dengan Hukum Lambert-Beer/ Hukum Beer yang dinyatakan sebagai berikut :

A = a b c

dimana : 

A = Absorbansi

a = absorbsivitas molar atau koefisien ekstingsi

b = tebal medium penyerap

c = konsentrasi (Molar)

Kurva Standar

Kurva standar merupakan kurva berupa garis linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi larutan standar (sumbu X) dengan nilai absorbansinya (sumbu Y). Dengan demikian, kurva standar dibuat dari satu seri konsentrasi larutan standar. Kurva standar digunakan untuk menghitung konsentrasi suatu larutan. Sebagai contoh, untuk menghitung kadar vitamin C suatu larutan sampel, diperlukan kurva standar asam askorbat. Nilai absorbansi yang diperoleh dari larutan sampel kemudian diplotkan dalam kurva standar asam askorbat sehingga dapat diketahui kadar asam askorbat (vitamin C) larutan sampel.

Pengukuran Kadar Vitamin C secara Spektrofotometri

Vitamin C adalah vitamin larut air yang sangat sensitif terhadap oksidasi, panas, dan alkali. Kerusakan oleh oksidasi dipercepat dengan kondisi basa, adanya garam-garam besi dan tembaga, panas, enzim oksidase, udara, dan cahaya. Vitamin C stabil dalam media asam, tetapi dalam media netral dan basa sangat mudah terdegradasi oleh panas. L-asam askorbat merupakan bentuk aktif dari vitamin C. Bentuk tersebut berada dalam kesetimbangan dengan bentuk L-dehidroaskorbat yang bersifat reversibel.

Oleh karena itu, kita dapat melihat pengaruh perlakuan pemanasan, penambahan alkali, garam besi dan pH terhadap stabilitas vitamin C. Dalam uji stabilitas vitamin C, vitamin C yang tersisa setelah terekspose oleh perlakuan tersebut akan dihitung kadarnya secara spektrofotometri. Vitamin C dapat dietntukan berdasarkan reduksi 2,6-diklorofenol indofenol oleh asam askorbat. Indofenol yang sering pula disebut dye yang berwarna biru dalam larutan basa dan merah dalam larutan asam, kemudian zat tersebut akan direduksi oleh asam askorbat membentuk dehidro asam-askorbat dan indofenol tereduksi hingga tidak berwarna. Semakin tinggi kadar vitamin C, maka absorbansi semakin rendah.

Aplikasi Spektrofotometri

Alat :

- UV-Vis spektrofotometer

- Tabung reaksi

- Pipet volumetrik 10 ml

- pH meter

- Pemanas

- Labu ukur 100 ml

Pereaksi :

- larutan asam metaphosfat HPO₃ 2% dalam air destilata.

- Larutan dye. Pembuatan : larutkan 100 mg 2,6-diklorofenol indofenol dan 84 mg sodium bikarbonat dalam air destilata panas (85-95^oC). Kemudian dinginkan dan encerkan sampai volume 100 ml. Saring dan encerkan 25 ml larutan tersebut sampai volume 500 ml dengan air destilata.

- Asam askorbat standar. Pembuatan : Timbang tepat 100 mg asam askorbat dan larutkan sampai volume 100 ml dengan HPO₃ 2%. Encerkan 4 ml larutan tersebut sampai volume 100 ml dengan HPO₃ 2%. (1 liter = 40 mg).

- Larutan NaOH 2N

- Larutan FeCl₂ atau FeCl₃

- Larutan HCl 0.1 M

Prosedur Pembuatan kurva standar asam askorbat

1. Atur pada angka transmisi 100% menggunakan blanko yang terdiri dari 5 ml HPO₃ 2% dan 10 ml air destilata. Kemudian, dalam satu seri kuvet/tabung reaksi kering masukkan larutan asam askorbat standar sebanyak 0, 0.1, 0.2, 0.5, 0.8, 1.0, dan 1.5 ml.
2. Encerkan semua tabung dengan HPO₃ 2% sampai volume 5 ml.
3. Tambahkan dengan cepat 5 ml larutan dye, kocok dan segera lakukan pengukuran absorbansi larutan (usahakan selesai dalam 15-20 detik). Penambahan sesaat sebelum pembacaan absorbansi.
4. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 518 nm.
5. Buat kurva hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi.

Prosedur Uji stabilitas vitamin C dalam minuman

Sampel yang digunakan adalah minuman kaya vitamin C. Pipet 5 ml larutan sampel ke dalam labu ukur 250 ml, encerkan dengan HPO₃ 2% sampai tanda tera. Kemudian, jika perlu lakukan saring atau sentrifus untuk mendapatkan larutan sampel yang jernih (tidak ada endapan)

A. Pengaruh Panas

1. Panaskan larutan sampel (10 ml) pada suhu 60, 80, dan 100 selama 15 menit dengan suhu kamar sebagai pembanding;
2. Kandungan vitamin C yang tersisa diukur dengan cara seperti yang dilakukan dalam pembuatan kurva standar asam askorbat.
3. Sebelumnya, atur alat pada angka transmisi 100% (atau A=0) menggunakan larutan blanko yang terdiri dari 5 ml HPO₃ 2% dan 10 ml air destilata. 
4. Ambil 0.5 ml larutan sampel yang telah diberi perlakuan panas kemudian ditepatkan hingga 5 ml dengan HPO₃ 2%.
5. Tambahkan dengan cepat 5 ml larutan dye, kocok, dan segera lakukan pengukuran absorbansi.
6. Ukur dan catat absrobansi larutan pada panjang gelombang 518 nm.

B. Pengaruh Kondisi Alkali/Basa

1. Atur pH larutan sampel (30 ml) yang tersedia dengan penambahan NaOH 2N. Ambil masing-masing sebanyak 5 ml pada saat pH awal, pH mencapai 7, 8, dan 9.
2. Kandungan vitamin C yang tersisa diukur menggunakan cara seperti sebelumnya.

C. Pengaruh Garam Besi

1. Tambahkan 5 ml larutan sampel (4 tabung) dengan masing-masing 0.5 ml larutan besi (FeCl₂ atau FeCl₃). Sebagai pembanding digunakan bahan tanpa penambahan besi;
2. Vortex hingga homogen;
3. Kandungan vitamin C yang tersisa diukur dengan cara sebelumnya.

Rumus perhitungan konsentrasi asam askorbat dalam contoh yaitu :